POUR ALLER PLUS LOIN
1. Obtention de la lignée rapportrice ifat1
La lignée rapportrice est obtenue suite à de nombreuses étapes expérimentales (Clarke, Shannon E., et al, 2014). Une première étape consiste en l'obtention du gène iFAT1 avant son insertion dans un plasmide. Après avoir procédé à son clonage, le gène iFAT1 est récolté puis inséré par recombinaison homologue dans le chromosome X d'un blastocyte. Les souris ainsi générées vont alors être croisées avec des souris C57BL/6J jusqu'à l'obtention de souris stables exprimant le gène iFAT1.
A) Obtention de la cassette transgèniquetransgénique iFAT1
Le gène iFAT1 est isolé d’un ver transparent nommé Caenorhabditis elegans (C.elegans). Il est ensuite converti par séquençage en un gène capable d’être transcrit puis traduit par la machinerie transcriptionelle des souris. La cassette transgénique contient :le gène iFAT1, une cassette stop floxée entre deux séquences LoxP, le promoteur CAG et le gène codant pour la fin de transcription (HGH polyA - figure 1).
B) Insertion du gène dans un plasmide
Le transgène iFAT1 est inséré dans le plasmide DMA1-HR afin d’être conservé et multiplié. Le vecteur obtenu est illustré en figure 1 et possède :
Backbone (en rose) : correspond aux gènes de réplication nécessaires au plasmide.
HPRT rescue : nécessaire à la recombinaison homologue entre le transgène iFAT1 et un locus du chromosome X (cf chapitre « insertion dans le chromosome X). Cela permet ainsi l’insertion du transgène iFAT1 dans un génome.
CAGGS promoter : déclenche la transcription du gène iFAT1 de manière ubiquitiaire.
PGK promoter/ neomycine/ PGKpoly A : disposés dans le sens inverse de la transcription du gène iFAT1 afin d’éviter une possible expression après transcription de la néomycine (=antibiotique). Sa transcription va permettre de sélectionner uniquement les vecteurs possédant la cassette transgénique après traitement à la HAT (= hypoxanthine, aminopterin et thymidine). En effet, la néomycine étant résistante à la HAT, seuls les vecteurs ayant intégrés la cassette survivront au traitement.
Stop : correspond à la cassette stop entre les séquences loxP
Fat-1-cds : correspond au transgène d’intérêt. Il a été inséré dans le plasmide grâce à des enzymes de restriction et des ligases.
HGH polyA : impliqué dans la terminaison de la transcription du gène iFAT1
Figure 1: Schéma détaillant le contenu du vecteur après insertion du transgène iFAT1 dans le plasmide DMA1-HR.
C) Insertion dans le chromosome X
Le cassette transgénique iFAT1 est insérée dans un locus du chromosome X nommé HPRT (hyposanthine phosphoribosyltransferase). Ce locus code pour une protéine qui a pour fonction principale la synthèse de purines. L’insertion du gène iFAT1 dans le chromosome X se fait par recombinaison homologue, c’est à dire par un échange de séquence de nucléotides entre des molécules d’ADN identiques ou similaires (figure 2).
Figure 2 : Schéma explicatif de la recombinaison homologue entre le transgène ifat1 et HPRT (locus du chromosome X).
La recombinaison est possible car une suppression d’une portion de HPRT a préalablement été réalisée. Cette portion a ensuite été insérée dans la cassette contenant le transgène iFAT1. Il s’agît de la séquence « HPRT rescue ». Ainsi, une recombinaison est nécessaire à la bonne synthèse des nucléotides de la cellule et permet alors l’insertion du transgène iFAT1. La reconnaissance entre les deux gènes est aussi possible grâce à des enzymes de restriction et des ligases.
D) Croisement des différents modèles génétiques
L’insertion de la cassette transgénique dans le locus HPRT se fait dans des cellules souches embryoniques E14Tg2a, des cellules souches qui dérivent de souris marrons 129P2/OlaHsd. Ces dernières sont couplées a des souris noires C57BL/6J, dont le génome est complètement connu, afin d’obtenir des souris chimères au pelage brun. Les descendances sont ensuite couplées avec des souris C57BL/6J jusqu’à l’obtention d’une lignée pure de souris possédant le transgène iFAT1.
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